Kollegen Bağ Dokunun Saptanması Analizi Nasıl Yapılır?

Kollegen Bağ Dokunun Saptanması

Yöntemin Prensibi
 
Örnekteki protein, asit ile hidroliz edilerek amino asitlerine parçalanır. Bu hidroliz ürününde bulunan hidroksiprolin miktarı kolorimetrik olarak tayin edilebilir. 

 
L (-) Hidroksiprolin Tayini
  
Örneğin Hazırlanması
 
Örnek soğuk iken (0 °C civarında) keskin bir bıçakla, bir kenarı yaklaşık 7-8 mm olacak şekilde, hacmi yaklaşık 0,5 cm3 olan küçük küpler halinde kesilir veya hermetik olarak kapatılmış kaplarda veya vakumlu kapatılmış ısıya dayanıklı plastik torbalarda en az 30 dakika 70 °C'da ısıtılır ve soğutulduktan sonra kıyma makinesi veya blenderde homojen hale getirilir.
 
Isıtma işlemi bağ dokuyu yumuşatır ve kıyma makinesi veya blenderde daha kolay homojenize edilmesini sağlar. Ancak jelatin içeren akışkan kısım aynlmaya başlayabilir. Bu nedenle ömeği hazırlarken ve tartarken çok iyi karıştırmak gerekir. Özellikle yağ ve akışkan kısımların tam  olarak dağıldığından emin olunmalıdır .

  
Kullanılan Malzemeler ve Cihazlar

• Terazi
• Pipet( 5 mL, 25 mL)
• Ağzı rodajlı balon (100 mL, 250 mL)
• Cam boncuk
• Isıtıcı
• Filtre kağıdı
• Huni
• Beher ( 600 mL)
• Balonjoje ( 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL, 2000 mL,)
• Deney tüpü
• Blender
• Spektrofotometre
• Spektrofotometre küveti 
• Mezür ( 100 mL)

Kullanılan Kimyasallar

1. 6 M hidroklorik asit çözeltisi : Derisik hidroklorik asit 1/1 oranında saf su ile seyreltilir
2. 4-hidroksiprolin-a-karbonik asit (hidroksiprolin)
3. İso-propanol (2-Propanol veya isopropil alkol) 
4. Kalay (II) klorür dihidrat- (SnCI2.2H2O): 7,5 g kalay (II) klorür dihidrat  500 mL saf su içerisinde çözülerek üzerine 500 mL derişik hidroklorik asit çözeltisi eklenir.
5. KloraminT (CH3C6H4SO2N(CI)Na.3H2O) 
6. p-dimetilaminobenzaldehit -( CH3)2 NC6H4CHO  
7. % 60’lık Perklorik asit  (HCIO4) 
8. Propanol (l-Propanol veya propil alkol) ( CH3CH2CH2OH) 
9. Sitrik asit monohidrat (C6H8O7.H2O) 
10. Sodyum asetat trihidrat (Na(CH3CO2).3H2O ) 

1 M ve 10 M sodyum hidroksit  çözeltisi (NaOH) : 4 g ve 40 g sodyum hidroksit saf suda çözülür ve son hacimleri 100 mL’ye tamamlanır.

Hidroksiprolin stok çözeltisi: 50 g 4-hidroksiprolin-a.-karbonik asit (hidroksiprolin) saf su içinde çözdürülüp, üzerine 1 damla 6 M hidroklorik asit çözeltisinden damlatılır ve toplam hacim 100 mL’ye tamamlanır.

Bu çözelti + 4 °C'da en az 1 ay dayanıklıdır.

Hidroksiprolin standart çözeltileri: Hidroksiprolin stok çözeltisinin 5 mL'si 500 ml saf su içinde sulandırılır ve bundan 10, 20, 30, 40 ve 50 mL alınıp 100 mL'ye suyla tekrar seyreltilirse bu çözeltilerin ml'sinde 0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 2,5 mg hidroksiprolin bulunur. Çözeltiler kullanılacağı zaman  hazırlanmalıdır .

Sitrat- asetat tamponu: 50 g sitrik asit monohidrat, 26,3 g sodyum hidroksit ve 146,1 g sodyum asetat trihidrat saf suda çözdürülür ve 1000 mL' ye tamamlanır. Bu çözeltinin üzerine ayrı bir balonjojede hazırlanmış olan 200 ml saf su ve 300 ml propanol karışımı eklenip karıştınlır. Bu çözelti +4 °C'da 1 hafta bozulmadan kalabilir.

Kloramin T çözeltisi: 1,41 g kloramin T , 10 ml saf suda çözdürülür .Üzerine 10 ml propanol ile 80 ml sitrat-asetat tampon çözeltisinden ilave edilir. Bu çözelti kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.
Renk reaktifi (p-dimetilaminobenzaldehit): 10 g p-dimetil aminobenzaldehit 35 mL %60'lık perklorik asit çözeltisinde çözdürülür. Sonra yavaşca 65 mL iso-propanol ile karıştınlır. Bu çözelti taze hazırlanmalıdır.

 
Deneyin Yapılışı
 
Homojen hale getirilmiş örnekten 4 g alınıp 250 mL'lik balona koyulur. Balona kaynamayı kolaylaştırmak için kaynama taşları ilave edilerek üzerine 100 mL kalay-2-klorürlü hidroklorik asit çözeltisi eklenir. Soğutucu altında, elektrikli ısıtıcıda yaklaşık bir gece ( 16 saat) hafif hafif kaynatılır. Sıcak hidrolizat süzgeç kağıdından 200 mL'lik ölçülü balona süzülür. Süzgeç kağıdı 10'ar mL'lik sıcak hidroklorik asit çözeltisi (6 M) ile 3 kez yıkanır. Yıkama çözeltileri hidroliz edilmiş çözeltiye ilave edilir. Balon işaret çizgisine kadar saf su ile tamamlanır ve karıştırılır. Deney en geç hidrolizin yapıldığı günü takip eden günde yapılmalıdır.
  
Hidrolize edilmiş çözeltiden belli bir hacimde (V ml) pipetle 400 mL’lik bir behere aktarılır. Alınacak miktar örnekteki bağ doku oranına göre 5 mL ile 25 mL arasında olmalıdır. Çözeltinin pH'sı önce 10 M sodyum hidroksit çözeltisi ile, gerekiyorsa sonra 1 M sodyum hidroksit çözeltisi ile 8,0' e ayarlanır. Beher içindekiler 250 ml'lik balonjojeye süzülür. Beher ve üzerinde kalay hidroksit çökeltisi olan süzgeç kağıdı, 30'ar mL saf su ile en az 3 kez yıkanır. Yıkama suları da balonjojeye aktarılır ve balon çizgiye kadar saf su ile tamamlanır ve iyice karıştırılır.
 
250 mL' ye sulandırılmış örnekten deney tüpüne 4 mL alınır. Kör için bir başka deney tüpüne 4 mL saf su koyulur. Kalibrasyon grafiği oluşturmak için de L( -) hidroksiprolin standart çözeltilerinden tüplere 4'er mL koyularak ve tüm tüplerin üzerine 2 mL kloramin T çözeltisi eklenir. Karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında 20 dk bekletilip üzerlerine 2 mL renk reaktifinden koyulur ve iyice karıştırıldıktan sonra ağızları kapatılır. Ağzı kapalı tüpler 20 dk 60°C'lık su banyosunda bekletilir. Isıtma sırasında tüplerin iç çeperlerinde yoğunlaşan suların inmesi için 20 dk'lık ısıtma sonunda tüpler soğutulur. Tüplerde oluşan renkli çözeltilerin absorbansları 558 nm'de köre karşı spektrofotometrede okunur. Oluşan renk 90 dk değişmeden kalabilir.
 
Hidroksiprolin standart çözeltileri ile oluşturulan kalibrasyon eğrisinden bilinmeyen örneğin hidroksiprolin içeriği saptanır.

 
Hesaplamalar
 
Kütlece % L( -) hidroksiprolin miktarı aşağıdaki formülle hesaplanır.
 
% Hidroksiprolin =  (5 x C ) / (m x V )
 
C = Örneğin kalibrasyon garfiğinden okunan L( -) hidroksiprolin konsantrasyonu
V = 5 -25 mL arasında alınan miktar
m = alınan numune miktarı